靶向蛋白质降解（TPD）是一种通过诱导E3泛素连接酶与靶向蛋白质接近，从而促进靶向泛素化和随后的蛋白酶体降解的新兴治疗工具。TPD在处理致病蛋白方面展现出巨大潜力。

此前，TPD主要通过两种方式实现：一是采用蛋白质降解-靶向嵌合体（PROTACs），这种双功能化合物由两个独立部分组成，分别与靶点蛋白和E3连接酶结合；二是使用单价结合的连接酶或靶点的分子胶。

新型BRD4双功能降解剂的作用机制

本文重点介绍一种名为分子内双价粘合剂（Intramolecular Bivalent Glues, IBGs）的新型BRD4双功能降解剂。这种设计为靶向蛋白质降解引入了新模式。与PROTACs通过trans构象连接目标蛋白和E3连接酶不同，IBGs则通过cis构象同时作用于目标蛋白的两个相邻结构域，从而增强与E3连接酶的亲和性。这种构象变化充分利用目标蛋白与连接酶的天然亲和力，将BRD4“粘”在E3连接酶DCAF16上，进而实现BRD4的降解；而这种降解在没有IBG的情况下则不会发生。

三元复合物形成的TR-FRET分析

通过时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）分析，评估BRD4与DCAF16之间的三元复合物的形成。该分析中采用了针对BRD4的铕标记抗体以及Cy5标记的DCAF16。如果IBG分子能够诱导标记的BRD4与DCAF16之间形成三元复合物，荧光团之间的距离将足够近以发生荧光共振能量转移（FRET）。

TR-FRET实验中，Cy5标记的DCAF16、His-BRD4和抗His铕标记供体的储备溶液被配制于TR-FRET缓冲液中。研究团队开展了两类实验：（1）将IBGs梯度滴定加入BRD4与Cy5-DCAF16的混合物中历史形成分析；（2）将Cy5-DCAF16滴定加入BRD4或BRD4+IBG中进行复合物稳定性分析。

双价分子胶的特性与评估

该研究的主要目标是体外表征DCAF16、BRD4与双价分子胶IBG1之间可能的相互作用。通过等温滴定量热法（ITC）观察到IBG1、DCAF16与BRD4 Tandem的形成。同时，TR-FRET复合物形成分析显示，在IBG1滴定条件下，BRD4 Tandem与DCAF16之间的复合物形成表现出剂量依赖性。综合上述，IBG1的活性明显强于其单价前体JQ1。

TR-FRET稳定性分析进一步证实，在IBG1存在的情况下，滴定DCAF16至BRD4 Tandem确实存在复合物形成。令人意外的是，即使不添加IBG1，DCAF16与BRD4 Tandem之间仍然表现出内在亲和力，这表明两者需要协同作用才能形成复合物。

优化后的IBG化合物

确认IBG1的作用机制后，研究人员合成了新化合物IBG3，以提高其对BRD4和DCAF16的粘合活性。新化合物IBG3在降解BRD4效率上超过IBG1，达到了低皮摩尔水平。此外，IBG3对BRD4–DCAF16复合体的粘合能力也有所增强。

总结

通过本文所描述的TR-FRET相互作用分析，能够有效表征BRD4-DCAF16之间的新型分子胶。这种新型分子内双价胶通过同时结合目标蛋白的两个结构域，增强其与E3连接酶的亲和力，形成新的相互作用模式。这一创新策略为靶向多种效应蛋白、重构细胞信号通路及实现蛋白降解等领域提供了广阔的前景。

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